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優(yōu)化、培養(yǎng)原代LYCO和LYCT細(xì)胞條件技術(shù)分享

原文標(biāo)題：Establishment and characterization of the gonadal cell lines derived from large yellow croaker (Larimichthys crocea) for gene expression studies.

 Doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.737300

發(fā)表文章單位：集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室     

背景：魚(yú)類細(xì)胞系在資源保護(hù)、遺傳育種、疾病防治、環(huán)境污染物檢測(cè)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。性腺細(xì)胞系的建立將為研究性別決定的分子調(diào)控機(jī)制以及性別相關(guān)基因的表達(dá)和功能提供合適的體外模型。

方法：采用改良Leibovitz L-15培養(yǎng)基，從幼魚(yú)的卵巢和精巢中分別建立了大黃魚(yú)卵巢細(xì)胞系（LYCO）和精巢細(xì)胞系（LYCT）。再通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基條件以提高LYCO和LYCT的生長(zhǎng)速度和增殖能力，包括ZETA-life胎牛血清（FBS）濃度、不同傳代比例、凍存和復(fù)蘇等。

結(jié)果：采用電穿孔法成功地將pEGFP-N1和pNanog-N1轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，表明該細(xì)胞系可用于研究外源基因和內(nèi)源基因的表達(dá)。LYCO表達(dá)卵泡細(xì)胞的標(biāo)記基因Foxl 2，而LYCT表達(dá)睪丸支持細(xì)胞的標(biāo)記基因Dmrt 1，且LYCO和LYCT不表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)志基因Vasa。表明LYCO和LYCT分別由卵泡細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞組成。在LYCO和LYCT中分別敲低Dmrt 1和Foxl 2后，獲得的細(xì)胞系可有效用于RNA介導(dǎo)的干擾（RNAi）實(shí)驗(yàn)和基因間相互作用的研究。

結(jié)論：作為第一個(gè)獲得的魚(yú)類性腺細(xì)胞系。本研究為大黃魚(yú)體細(xì)胞與生殖細(xì)胞的相互作用提供了一種新的模型，為大黃魚(yú)生殖細(xì)胞的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為今后海水魚(yú)類性腺細(xì)胞培養(yǎng)的研究奠定了基礎(chǔ)。
文章引用：

Primary culture and subculture

When the primary cells were fully expanded, the subculture was started with a 0.25% trypsin digestion method, and the cell culture bottle was gently turned back and forth. The trypsin was sucked out after most of the cells became round, then 3 mL of new culture medium and 2mL of old culture medium were added again. The cells were gently transferred to the new culture bottle for constant temperature culture.The FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500) concentration remained at 16.7% in the early stage of cell culture and gradually decreased to 10% FBS when the cells were passed to passage 20 (P20),and the morphology turned good. During the first 30 subcultures, the cells were split at a ratio of 1:2 every 2–3 days.    

結(jié)果引用:

以澳洲胎牛血清FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)血清進(jìn)行的LYCO和LYCT的原代培養(yǎng).A和B分別表示第2天和第5天的LYCO原代培養(yǎng)細(xì)胞; C和D分別表示第5天和第7天的LYCT原代培養(yǎng)細(xì)胞。隨著傳代的進(jìn)行，LYCO主要由卵巢體細(xì)胞和生殖細(xì)胞（卵細(xì)胞等）組成。繼代培養(yǎng)后，LYCT的形態(tài)沒(méi)有明顯變化，擴(kuò)增速度加快。3-4 d內(nèi)子代細(xì)胞覆蓋率達(dá)100%。目前，細(xì)胞已穩(wěn)定傳代至第80代（P80）。

E和F分別顯示在LYCO和LYCT中用pNanog-N1轉(zhuǎn)染后的綠色熒光蛋白（GFP）。檢測(cè)到強(qiáng)烈的綠色熒光信號(hào)，證明轉(zhuǎn)染效率高。G表示用不同濃度的澳洲胎牛血清FBS(Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)培養(yǎng)LYCO和LYCT。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞幾乎不在含0%和5%FBS的培養(yǎng)基中擴(kuò)增。當(dāng)FBS濃度為10%、15%、20%時(shí)，細(xì)胞能正常生長(zhǎng)并充分增殖。當(dāng)FBS濃度為15%或20%時(shí)，細(xì)胞迅速擴(kuò)增，覆蓋率可達(dá)90%。因此，在早期細(xì)胞培養(yǎng)中，可選擇含15%或20% FBS的培養(yǎng)基。

原文培養(yǎng)原代大黃魚(yú)卵巢細(xì)胞（LYCO）和大黃魚(yú)精巢細(xì)胞（LYCT）方法總結(jié)
通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基條件以提高LYCO和LYCT的生長(zhǎng)速度和增殖能力。其中包括使用不同濃度的胎牛血清（FBS，Zeta life, Australia Origin, Z7010FBS-500）來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，為研究出最佳LYCO和LYCT的生長(zhǎng)速度和增殖能力提供可靠數(shù)據(jù)。研究證明當(dāng)FBS濃度為15%或20%時(shí)，細(xì)胞迅速擴(kuò)增，覆蓋率可達(dá)90%。因此，在早期細(xì)胞培養(yǎng)中，可選擇含15%或20% FBS的培養(yǎng)基。

引用產(chǎn)品

胎牛血清fetal bovine serum (Zeta life, USA) ；

熱門(mén)產(chǎn)品
Z7010FBS-500,胎牛血清（澳洲血源）；Z7181FBS-500,胎牛血清（烏拉圭血源）；Z7186FBS-500,胎牛血清（法國(guó)血源）；Z7185FBS-500,胎牛血清（巴西血源）；Z7187FBS-500,胎牛血清（墨西哥血源）；Z7180FBS-500,胎牛血清（超低內(nèi)毒素血清）；AD600150，Advanced DNA RNA 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑；AV500150，小動(dòng)物活體轉(zhuǎn)染試劑Advanced DNA RNA；CE80100T，無(wú)血清細(xì)胞凍存液 Plus ZT10002-5ml，支原體去除試劑(MRA)
ZETA life FBS（胎牛血清）簡(jiǎn)介：
  美國(guó)ZETA life公司成立于1989年，是國(guó)際無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12主要完成人，有幾十年的胎牛血清、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基、以及干細(xì)胞、免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等多種不同類型哺乳動(dòng)物細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)液生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)；ZETA life也是目前世界胎牛血清、無(wú)血清培養(yǎng)基最大的OEM供應(yīng)商之一；每批血清均有完整的血源證明文件、獸醫(yī)師檢驗(yàn)證明及品質(zhì)測(cè)試報(bào)告；ZETA life胎牛血清在100級(jí)的無(wú)菌間采用全自動(dòng)方式制造生產(chǎn)，具有良好的可再現(xiàn)性及可追溯性。