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轉(zhuǎn)染原代BMDM細(xì)胞技術(shù)分享

影響影子：IF:12.40
發(fā)表期刊:Theranostics
Doi: 10.7150/thno.66420

原文標(biāo)題：5-aza-2′-deoxycytidine potentiates anti-tumor immunity in colorectal peritoneal metastasis by modulating ABC A9-mediated cholesterol accumulation in macrophages。
背景：5-aza-2'-脫氧胞丁胺（5AZA），是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）抑制劑，可激活腫瘤適應(yīng)性免疫，抑制腫瘤進(jìn)展。然而，5Aza調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的分子機(jī)制仍不清楚。
方法：研究了5AZA在結(jié)直腸癌（CRC）的腹膜癌（PC）免疫微環(huán)境中的作用。 通過流式細(xì)胞儀，實(shí)時(shí)PCR，Western印跡測定法和藥物親和力響應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性（DARTS）研究了5AZA對(duì)巨噬細(xì)胞激活的影響。 5AZA對(duì)CRC患者的基質(zhì)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞中驗(yàn)證了5AZA對(duì)腫瘤免疫力的影響。
結(jié)果：5Aza可以刺激巨噬細(xì)胞向M1樣表型的激活，并隨后刺激轉(zhuǎn)移前脂肪組織中T細(xì)胞的激活，最終抑制免疫功能小鼠模型中的CRC-PC。從機(jī)制上講，5Aza刺激原代小鼠巨噬細(xì)胞向M1樣表型發(fā)展，其特征是p65磷酸化和IL-6表達(dá)增加。此外，我們篩選并鑒定了ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A9（ABC A9）作為5Aza的結(jié)合靶標(biāo)。5Aza以ABC A9依賴的方式誘導(dǎo)膽固醇積累、p65磷酸化和IL-6表達(dá)。NF-κB的藥理學(xué)抑制或IL-6的遺傳耗竭消除了5Aza在小鼠中的抗腫瘤作用。此外，常規(guī)化療藥物5-Fu或OXP協(xié)同增強(qiáng)了5Aza的抗腫瘤作用。最后，我們驗(yàn)證了5Aza在CRC患者基質(zhì)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞抗腫瘤免疫中的重編程作用。

結(jié)論：綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)表明5AZA通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞依賴性的T細(xì)胞激活前分散微環(huán)境中抑制了CRC-PC，同時(shí)抑制了CRC-PC。發(fā)現(xiàn)了5AZA在調(diào)節(jié)ABC A9相關(guān)的膽固醇代謝和巨噬細(xì)胞激活方面的DNA甲基化獨(dú)立機(jī)制。
文章引用：

Small interfering RNA (siRNA)-mediated gene silencing

We used transfection reagent (#AD600150, ZETA life, USA) to transfect specific siRNA of ABC A9 into cells to silence their expression according to the manufacturer’s protocol. Briefly, macrophages were placed in a 6-well plate with a density of 2.5 × 105 cells. Transfection was performed when the cell density was 70%. 10 µL of siRNA (100 pmol/mL) and 10ul of transfection reagent were mixed at room temperature for 15 min, and then added into a 6-well plate containing 1ml of normal DMEM. After 24 h, the culture medium was removed and fresh DMEM medium was added to continue culture.

文章轉(zhuǎn)染BMDM細(xì)胞方法總結(jié)
我們使用轉(zhuǎn)染試劑（＃AD600150，ZETA life，USA）將ABC A9的特定siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，根據(jù)制造商的規(guī)程使其表達(dá)沉默.簡而言之，將BMDM巨噬細(xì)胞放在6孔板中，密度為2.5×105細(xì)胞。 當(dāng)細(xì)胞密度為70％時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 在室溫下混合10 µL siRNA（100 pmol/mL）和10 ul轉(zhuǎn)染試劑并靜止15分鐘，然后加入含有1ml正常DMEM的6孔板中。24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基并添加新鮮的DMEM培養(yǎng)基以繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收細(xì)胞。

引用產(chǎn)品

AD600150，Advanced DNA RNA transfection reagent（Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑）；
熱門產(chǎn)品
AV500150，小動(dòng)物活體轉(zhuǎn)染試劑Advanced DNA RNA；
P400150，Sirius DNA轉(zhuǎn)染試劑；
Z7181FBS-500,胎牛血清（烏拉圭血源）；
Z7010FBS-500,胎牛血清（澳洲血源）；
BM0001-100，雙抗;
BM0002-100，0.25%胰酶;
ZETA life轉(zhuǎn)染試劑簡介：
  2018年ZETA life公司與美國加利福尼亞大學(xué)舊金山校區(qū)聯(lián)合開發(fā)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染的Advanced DNA RNA第三代多肽小分子轉(zhuǎn)染試劑，此技術(shù)成為新的全球蛋白功能、免疫細(xì)胞及干細(xì)胞研發(fā)及生產(chǎn)的主要關(guān)鍵技術(shù)之一。ZETA life，Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)勢：

1.第三代多肽小分子轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)入細(xì)胞后可幾小時(shí)內(nèi)快速被代謝對(duì)細(xì)胞不毒素影響;
2.可轉(zhuǎn)染極度難轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞，懸浮細(xì)胞，原代細(xì)胞、干細(xì)胞等；
3.使用ZETA life轉(zhuǎn)染試劑已發(fā)表文章的轉(zhuǎn)染細(xì)胞名稱：
THP-1、RAW264.7、小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2、小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞（N2A)、懸浮淋巴白血病細(xì)胞K562；

原代骨髓巨噬細(xì)胞(BMDM)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)、造血干/祖細(xì)胞(HSCs/HPCs)、原代精原干細(xì)胞(SSCs)、原代大鼠肝細(xì)胞（Hepatocytes ）、原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(BEECs)、原代牛乳腺上皮細(xì)胞 (BMECs)、原代雞胚肝細(xì)胞（CEHs）；NIH-3T3、人正常肝細(xì)胞 LO2、豬腎細(xì)胞PK-15、人舌鱗癌細(xì)胞SCC-25，CAL27；結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116 SW480 HT-29）等。