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產(chǎn)品貨號: K009-100、K009-500、K009-1000、K009-3000

產(chǎn)品規(guī)格: 100T/500T/1000T/3000T

產(chǎn)品品牌:Zeta Life

產(chǎn)品概述：

CellCounting Kit簡稱CCK試劑盒，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學名：2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

CCK是MTT的一種升級替代產(chǎn)品，和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點：

-CCK被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成的formazan是水溶性，不需要有特定的溶解液來溶解，而WST和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都不是水溶性的，因而可以省去后續(xù)溶解步驟。

-CCK比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實驗結(jié)果更加穩(wěn)定。

-CCK和MTT、XTT等相比線性范圍更寬，靈敏度更高。

CCK毒性：CCK和其他檢測方法相比，對細胞幾乎無毒性，不傷害細胞，細胞可重復利用。

CCK應(yīng)用：藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏實驗。

操作說明：

一、制作標準曲線(測定細胞具體數(shù)量時)

1、先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞。

2、按比例(例如：1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標(X軸)，OD值為縱坐標(Y軸)的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量(試用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入CCK后的培養(yǎng)時間)。

二、細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液(100ul/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)(在37℃，5% CO2的條件下)。

2、向每孔加入110ul的CCK 溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù))。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10ul 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

三、細胞增值-毒性檢測

1、在96 孔板中配置100ul的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(在37℃，5% CO2的條件下)。

2、向培養(yǎng)板加入10ul不同濃度的待測物質(zhì)。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間(例如：6、12、24或48小時)。

4、想每孔加入10ul CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù))。

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

7、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10ul 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基(除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基)，去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

備注：

① 建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK試劑后的培養(yǎng)時間。

② 有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔減的差異。加入

CCK試劑時，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基頁面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會干擾OD值讀數(shù)。

③ 白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。

④ 當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000個/孔(100ul培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔(100ul培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK溶液。

⑤ 如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。

⑥ 培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

活力計算：

細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100

A(加藥)：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A(0加藥)：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

保存條件：

4℃避光保存，有效期一年。

美國Zeta Life公司成立于1989年，是無血清細胞培養(yǎng)基DMEM/F12主要完成人，有三十多年的胎牛血清、無血清細胞培養(yǎng)基、以及干細胞、免疫細胞及腫瘤細胞等多種不同類型哺乳動物細胞的無血清培養(yǎng)液生產(chǎn)經(jīng)驗；也是目前世界胎牛血清、無血清培養(yǎng)基最大的供應(yīng)商之一；每批血清均有完整的血源證明文件、獸醫(yī)師檢驗證明及品質(zhì)測試報告；

2018年美國Zeta Life公司與美國加利福尼亞大學舊金山校區(qū)聯(lián)合開發(fā)活細胞、活體動物體轉(zhuǎn)染試劑，此技術(shù)成為蛋白功能、免疫細胞及干細胞治療、研發(fā)及生產(chǎn)的主要關(guān)鍵技術(shù)之一。