技術(shù)服務(wù)介紹
DNA甲基化存在于大多數(shù)真核生物中，一般發(fā)生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶的5’UTR區(qū)，起調(diào)控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化，20%處于基因調(diào)控區(qū)的CpG島中。BSP甲基化測(cè)序（Bisulfite Genomic Sequencing PCR）的原理通過對(duì)基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，非甲基化的胞嘧啶被脫氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，在隨后的PCR反應(yīng)中尿嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脫氨基，在反應(yīng)完成時(shí)被保留，我們將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測(cè)序，就可以分析甲基化發(fā)生的具體情況。該方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性高，是甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。通過對(duì)疾病及正常對(duì)照樣本的靶基因進(jìn)行甲基化分析，在研究腫瘤發(fā)生機(jī)制及早期診斷等方面均具有重要的臨床意義。
實(shí)驗(yàn)流程
Q：常見的甲基化測(cè)定方法有哪些，優(yōu)缺點(diǎn)是什么？
常見方法 | 優(yōu)缺點(diǎn) |
MSP法（Methylation-specific PCR，MSP）：重亞硫酸鹽處理基因組DNA，分別設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果對(duì)甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。 | 無需挑克隆測(cè)序，步驟簡(jiǎn)單，但對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求較高，容易出現(xiàn)PCR假陽性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。 |
BSP法（Bisulfite sequencing PCR ，BSP）：重亞硫酸處理基因組DNA，設(shè)計(jì)BSP引物擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物克隆至T載體測(cè)序，分析CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。 | 可明確樣本待測(cè)區(qū)段每個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化程度；受實(shí)驗(yàn)方法和價(jià)格因素限制無法高通量。 |
高分辨率熔解曲線法（High Resolution Melting ，HRM）：重亞硫酸處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，導(dǎo)致樣品中的GC含量發(fā)生改變后溶解溫度變化，從而進(jìn)行分析。 | 檢測(cè)方法高通量，但是無法明確每個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化程度。 |
客戶須知：
| 實(shí)物 | 數(shù)據(jù)信息 | 實(shí)驗(yàn)周期 |
客戶提供 | 待測(cè)樣本 | 待測(cè)序列信息 | 7周或以上 |
我們提供 | 無 | 基本實(shí)驗(yàn)步驟、測(cè)序報(bào)告、圈點(diǎn)圖 |
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