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流式細(xì)胞儀檢測(cè)A172細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)報(bào)告
更新時(shí)間:2019-12-09   點(diǎn)擊次數(shù):2589次

一、 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

表格一:實(shí)驗(yàn)儀器

儀器

廠家

型號(hào)

細(xì)胞培養(yǎng)箱

Thermo Scientific

HERA cell CO2

低溫高速離心機(jī)

64R

BECKMAN  

流式細(xì)胞儀

BD

FACS Calibur

 

表格二:試劑

試劑

廠家

DMEM 培養(yǎng)液

Hyclone

PI

Sigma

PBS 7.4 (0.1 M)

自配

乙醇

國(guó)藥集團(tuán)

RNA 酶

Sigma

二、 實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A172 細(xì)胞,按 1*105個(gè)/mL 以 1mL 體積接種于 6 孔板內(nèi)。無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜,到轉(zhuǎn)染時(shí)使細(xì)胞達(dá)到 70%的匯合率。

轉(zhuǎn)染

將 12.5uL siRNA 溶于 387.5uL 無(wú)血清的 DMEM 中,混合均勻。

將 12.5uL Lipofectamine 2000 溶于 387.5uL 無(wú)血清的 DMEM 中,混合均

勻。在室溫下孵育 5 分鐘。

將上述兩種混合物混合(總體積 800uL),輕輕混合均勻在室溫下孵育

20 分鐘形成復(fù)合物。

在 6 孔板中每孔加入 800uL 復(fù)合物。十字法混合均勻。

細(xì)胞在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6h 后棄上清液,并加入 10%胎牛血

清的 DMEM 培養(yǎng)液。

固定

培養(yǎng) 48h 后小心吸去上清,胰酶消化并離心收集細(xì)胞(1000rpm/min),棄上清,用預(yù)冷 PBS 洗細(xì)胞 2 次,加入預(yù)冷 70%乙醇, -20℃固定保存。

染色

離心,棄上清;

1mL PBS 洗 1 次,離心;

加入 10uL RNase A(20ug/mL)于 500uL PBS, 37 度 30min 孵育后,離心;

PBS 洗 1 次,離心;

加 10uL PI (50 ug/mL)于 500 uL PBS,室溫避光 30min。  

檢測(cè)

以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè),汞激發(fā)波長(zhǎng) 488nm,計(jì)數(shù) 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,結(jié)果

使用 Modfit 軟件分析。

三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

省略

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